РАЗРАБОТКА ЛАБОРАТОРНЫХ МЕТОДОВ И ПРОМЫШЛЕННОЙ ТЕХНОЛОГИИ ПРОИЗВОДСТВА ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ

еморрагическая лихорадка с почечным синдромом (ГЛПС) -- вирусный нетрансмиссивный зооноз, широко распространенный в Евразии, а в России занимающий одно из первых мест среди всех природно-очаговых болезней человека. Случаи заболевания ГЛПС регистрируются в 58 из 83 административных регионов Российской Федерации и составляют ежегодно 8--10 тыс. больных в целом по стране. Отсутствие тенденции к снижению заболеваемости ГЛПС, расширение ареала инфекции, участившиеся случаи вспышек ГЛПС, ассоциированных с новыми, ранее не известными в России хантавирусами, свидетельствует о возрастающей медицинской и социальной значимости проблемы ГЛПС.

Открытию возбудителя ГЛПС предшествовал более чем 40-летний период поисков, успешно завершившийся в конце 70-х гг., когда впервые вирус-возбудитель ГЛПС был выделен в Южной Корее от полевой мыши Apodemus agrarius coreae.

Несколько лет после открытия возбудителя ГЛПС единственным лабораторным методом для выявления антигена вируса-возбудителя ГЛПС и антител к нему оставался непрямой метод флюоресцирующих антител (МФА) с использованием препаратов криостатных срезов легочной ткани полевых мышей.

Иммунологические методы:

•    непрямой МФА с использованием антиген •    реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) [2]; •    реакция торможения непрямой гемагглютинации (РТНГА) с использованием эритроцитарного диагностикума ГЛПС [2]; •    два варианта радиоиммунологического анализа (РИА): родо специфическая РИА-тест-система (прямой вариант) для определения антигенов хантавирусов и блок прямого РИА для определения антител к хантавирусам

Вирусологические методы:

•    обнаружение и титрование вируса по индикации вирусспецифического антигена в клетках VERO-Е6 с использованием непрямого МФА; •    обнаружение и титрование вируса с использованием феномена фокус образующих единиц (ФОЕ) [10, 11]; •    реакция нейтрализации.

Метод титрования вирусных частиц с использованием феномена ФОЕ использован в собственной модификации ранее описанного метода. Была изменена концентрация метилцеллюлозы в покрытии (0,4% для вирусов Puumala и Tula); в качестве специфических антител использована сыворотка реконвалесцента ГЛПС-Пуумала с титром антител ≥ 32 000; в качестве выявляющих антител -- меченный пероксидазой белок А; в индикаторную систему добавляли краситель -- NiCl2, благодаря чему инфекционные фокусы «бляшки» приобретают более контрастный темный цвет.

Молекулярно-генетические методы: •    выделение хантавирусной РНК с использованием гнездовой ПЦР с обратной транскрипцией; •    амплификация и секвенирование нуклеотидных последовательностей РНК-сегментов хантавирусного генома.

Если вирусологические и молекулярно-генетические методы в полном вышеуказанном составе вошли в этот комплекс, то среди иммунологических методов наибольшие преимущества получили четыре метода: непрямой МФА с использованием культурального антигена -- для выявления антител к хантавирусам у людей и животных; прямой метод ИФА -- для выявления хантавирусного антигена в органах мелких млекопитающих и секционных материалах погибших от ГЛПС людей; непрямой метод ИФА с использованием рекомбинантных антигенов хантавирусов -- для выявления IgM и IgG антител к хантавирусам -- для серодиагностики ГЛПС у больных людей, а также два метода ИФА с использованием моноклональных антител «Ханта-ПУУ» и «Ханта-N» для определения нуклеокапсидного и поверхностного белков хантавирусов при изготовлении инактивированных вакцинных препаратов против ГЛПС.

Диагностикум геморрагической лихорадки с почечным синдромом культуральный, поливалентный для непрямого метода иммунофлюоресценции.

До разработки технологии изготовления культурального поливалентного диагностикума в том виде, в котором этот препарат был передан для промышленного освоения, пройден длительный и важный этап его конструирования. Этот этап был связан с усовершенствованием и оптимизацией процессов изготовления диагностического препарата, обусловленных как использованием в технологии новых данных, касающихся особенностей гуморального иммунитета при ГЛПС, антигенной вариабельности хантавирусов и их репродукции в культуре клеток, так и чисто практическими проблемами, возникавшими при широком применении диагностикума. Иммуноферментная тест-система «Хантагност» для определения антигенов хантавирусов

При разработке промышленной технологии изготовления иммуноферментной тест-системы «Хантагност» были проведены исследования по изучению формирования гуморального иммунитета у больных ГЛПС с целью выбора оптимальных сроков забора крови у реконвалесцентов. Кроме того, были оптимизированы условия конъюгации иммуноглобулина с пероксидазой хрена, условия постановки иммуноферментного анализа и режим хранения иммунохимических компонентов тест-системы. Определены чувствительность и специфичность тест-системы при выявлении культуральных (клетки VERO-E6) антигенов вирусов-возбудителей ханта вирусных инфекций: Puumala, Hantaan, Seoul, Dobrava/Belgrad и Sin Nombre, а также показана высокая эффективность применения тест-системы при проведении широких эпизоотологических исследований (выявление хантавирусного антигена у диких грызунов) на территории России. Лабораторные серии тест-системы «Хантагност» успешно прошли испытания в ГИСК им. Л.А. Тарасевича и рекомендованы для внедрения в медицинскую практику.

Заключение

Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом занимает ведущее место по заболеваемости среди природно-очаговых инфекций в России. Заболевание протекает как острая инфекция с поражением почек, легких, центральной нервной и гормональной систем, наличием в ряде случаев тяжелых осложнений в остром периоде, приводящих к летальным исходам, и характеризуется длительным сроком восстановления до полного выздоровления. В этой связи проблема ГЛПС представляет серьезную медико-социальную проблему.